La reina Isabel falleció el 26 de noviembre de 1504, y aunque le encomendó la regencia de Castilla, la nobleza castellana no lo apoyó, por lo que se retiró a sus estados de Aragón (convenio de Villafáfila, 1506).
De su matrimonio (1505) con Germana de Foix nació un hijo, Juan, que murió en 1509.
Muerto súbitamente Felipe el Hermoso (1506), el cardenal Cisneros lo llamó a Castilla, adonde Fernando regresó en 1507.
Sus primeras medidas fueron reprimir los excesos de la nobleza y reanudar las exploraciones transoceánicas, abandonadas desde la muerte de Colón y de su protectora la reina.
En el exterior invirtió muchos recursos en las empresas africanas (Oran, 1509; Gelves, 1510).
Pronto renacieron las luchas en Italia, Fernando aprovechó la alianza del rey Juan III de Navarra con Francia para ocupar el reino de Navarra (1512), pero años después no pudo impedir que Francisco I de Francia, tras el éxito de Marignano (13-14 septiembre de 1515), ocupara el Milanesado.